Trung tâm công nghệ sinh học Thành Phố Hồ Chí Minh
 

ĐIỀU CHỈNH PHẢN ỨNG TỎNG HỢP CDNA TRONG QUY TRÌNH RT-PCR CHẨN ĐOÁN TILAPIA LAKE VIRUS ĐỂ TĂNG ĐỘ NHẠY

Thứ năm - 01/07/2021 10:13
Tilapia Lake virus (TiLV) được tìm thấy lần đầu tiên trên cá rô phi nuôi vào năm 2014 tại Israel (Eyngor et al., 2014a). Đây là loại virus RNA mạch đơn, sợi âm, có vỏ bọc và chứa 10 đoạn trình tự mã hóa cho 14 protein (Bacharach et al., 2016; Eyngor et al., 2014a; Surachetpong et al., 2017), với kích thước từ 55 đến 100 nm (Del-Pozo et al., 2017; Eyngor et al., 2014a; Ferguson et al., 2014; Surachetpong et al., 2017; Acharya et al., 2019). Tỷ lệ chết trong các ổ dịch tự nhiên từ 09-90%; bệnh xuất hiện ở mọi lứa tuổi nhưng chủ yếu tập trung ở cá giống (01-03 tháng tuổi). Cá rô phi đỏ (cá diêu hồng) giống nuôi lồng bị nhiễm bệnh, tỷ lệ chết có thể lên tới 90% trong vòng một tháng sau thả. Bệnh lây lan theo chiều ngang từ cá bệnh sang cá khỏe trong cùng ao nuôi, trại nuôi, qua nguồn nước, dụng cụ … (Cục Thú y, 2017); đồng thời theo chiều dọc từ cá bố mẹ sang cá con thông qua trứng và tinh trùng cá (Dong et al., 2020). Nguy cơ TiLV xâm nhiễm vào Việt Nam thông qua đường nhập khẩu cá rô phi giống (Thái Lan, Đài Loan, Israel, Philippin,...) là rất cao do bệnh này chưa có trong danh sách các bệnh phải công bố dịch theo quy định của OIE (Jansen et al., 2019) và pháp luật hiện hành của Việt Nam (Cục Thú y, 2017a). Ngoài ra, Cục Thú y đã tổ chức phối hợp các đơn vị liên quan tổ chức điều tra, lấy mẫu xét nghiệm TiLV trên cá rô phi, tính đến nay đã lấy và xét nghiệm 257 mẫu cá tại 15 tỉnh, thành phố, trong đó có 60 mẫu (chiếm 26,43%) dương tính với TiLV (Chi cục Chăn nuôi, Thú y và Thủy sản tỉnh Bình Dương, 2017).

Quy trình semi – nested RT-PCR khuếch đại đoạn trình tự thứ 3 của TiLV với bộ mồi gồm Nested ext-1 (5’-TAT GCA GTA CTT TCC CTG CC-3’), ME1 (5’-GTT GGG CAC AAG GCA TCC TA-3’) và 7450/150R/ME2 (5’-TAT CAC GTG CGT ACT CGT TCA GT-3’) (Eyngor et al., 2014; Kembou Tsofack et al., 2017; Dong et al., 2017) là quy trình phổ biến, hiện được các Trung tâm chẩn đoán virus TiLV sử dụng (TCCS 05:2017/TY-TS). Sau đó, Taengphu phát triển quy trình tương tự trên đoạn trình tự số 1 của chủng TiLV được cho là có độ nhạy cao gấp 100 lần so với quy trình RT-PCR trên đoạn trình tự số 3 của TiLV với bộ mồi gồm TiLV/nSeg1F (5′-TCT GAT CTA TAG TGT CTG GGC C-3′),  TiLV/nSeg1R (5′-AGT CAT GCT CGC TTA CAT GGT-3′) và TiLV/nSeg1RN (5′- CCA CTT GTG ACT CTG AAA CAG -3′) (Dong et al., 2020; Taengphu et al., 2020).

Trong cả 2 quy trình, phản ứng tổng hợp cDNA, phản ứng PCR1, PCR2 có thành phần và chương trình nhiệt gần như nhau, chỉ khác ở cặp mồi sử dụng (bảng 1). Thành phần và chương trình nhiệt chi tiết được công bố bởi Ngô Huỳnh Phương Thảo và cs (2021).
1

Tuy nhiên, theo nhóm nghiên cứu của Ngô Huỳnh Phương Thảo và cs (2021), khi sử dụng cùng 01 mẫu RNA để so sánh khả năng chẩn đoán TiLV của quy trình semi-nested RT-PCR trên đoạn trình tự số 3 và số 1 thì quy trình RT-PCR khuếch đại sử dụng bộ mồi khuếch đại đoạn trình tự số 3 lại cho kết quả nhạy hơn (hình 1). Ngoài ra, hầu hết các phương pháp PCR đã được thiết lập căn cứ trên bộ gen TiLV trên thế giới đều hướng đến đoạn trình tự thứ 3 của TiLV. VD: RT-PCR (Eyngor et al., 2014), nested RT-PCR (Kembou Tsofack et al., 2017), semi-nested RT-PCR (Dong et al., 2017a; Taengphu et al., 2020), RT-qPCR (Kembou Tsofack et al., 2017; Tattiyapong et al., 2017; Waiyamitra et al., 2018) và RT-LAMP (Phusantisampan et al., 2019; Yin et al., 2019). Theo Ngô Huỳnh Phương Thảo và cs (2021), việc khảo sát trên quy mô mẫu lớn hơn và nồng độ mẫu khác nhau cần được triển khai để kiểm chứng thêm về độ nhạy và độ đặc hiệu của các quy trình semi-nested RT-PCR.
 
2

Hình 1: Kết quả chẩn đoán TiLV của các quy trình semi-nested RT-PCR căn cứ trên đoạn trình tự số 3 (Ex1/ME1) của Dong et al. (2017), trên đoạn trình tự số 1 (nSeq1F/R) của Taengphu et al. (2020). M: thang DNA 1kb (Thermo); 1,2,3: mẫu RNA của TiLV tách bằng các phương pháp khác nhau; (-): chứng âm

Theo bài báo “Điều chỉnh quy trình semi-nested RT-PCR chẩn đoán Tilapia Lake Virus (TiLV) và bước đầu phân lập TiLV từ cá rô phi Việt Nam”- Tác giả liên hệ: Ngô Huỳnh Phương Thảo (nhpthao.snn@tphcm.gov.vn)

 

Tác giả bài viết: Nguyễn Hoàng Thụy Vy - P. CNSH Thủy sản

Tổng số điểm của bài viết là: 0 trong 0 đánh giá

Click để đánh giá bài viết

Những tin mới hơn

Những tin cũ hơn

Lượt truy cập
  • Đang truy cập17
  • Máy chủ tìm kiếm2
  • Khách viếng thăm15
  • Hôm nay1,286
  • Tháng hiện tại129,549
  • Lượt truy cập:12118849
Liên kết web
Bộ giống vi sinh vật
0101
Bạn đã không sử dụng Site, Bấm vào đây để duy trì trạng thái đăng nhập. Thời gian chờ: 60 giây