Trung tâm công nghệ sinh học Thành Phố Hồ Chí Minh

Sự gia tăng của các tế bào miễn dịch có nguồn gốc từ tế bào gốc đa năng cảm ứng iPSC và kỹ thuật dựa trên CRISPR đang định hình lại bộ gen chức năng, nhưng việc xác nhận cấp độ protein vẫn gặp khó khăn để theo kịp.

Sự gia tăng của các công nghệ tế bào gốc iPSC đã mở ra những con đường mới để mô hình hóa sinh học của con người và thăm dò các cơ chế cơ bản của các phản ứng miễn dịch. Trong số các loại tế bào hứa hẹn nhất có nguồn gốc từ iPSC là đại thực bào - các lính gác đa năng, cư trú trong mô, có liên quan đến viêm, nhiễm trùng và tiến triển bệnh. Tuy nhiên, bất chấp tiềm năng của chúng, các đại thực bào có nguồn gốc từ iPSC nổi tiếng là khó điều khiển di truyền và thậm chí còn khó phân tích hơn ở cấp độ protein do số lượng hạn chế và sinh học mong manh của chúng.

Trong phòng thí nghiệm của Daniel Ebner tại Viện Khám phá Mục tiêu của Đại học Oxford, Elena Navarro-Guerrero đang đẩy giới hạn của những gì có thể với các đại thực bào có nguồn gốc từ iPSC. Với tư cách là Trưởng phòng Bộ gen chức năng, cô ấy đã giúp thiết kế các tế bào miễn dịch này với hiệu quả đáng kể - nhưng việc tạo ra các tế bào được chỉnh sửa chỉ là một nửa trận chiến. Vấn đề khó khăn hơn tiếp theo là: chứng minh, ở cấp độ protein, rằng những chỉnh sửa đó thực sự hiệu quả.

Các xét nghiệm protein truyền thống, được xây dựng cho vật liệu dồi dào và điều kiện dễ tha thứ, chùn bước khi đối mặt với các mẫu khan hiếm, mong manh. Công trình của Navarro-Guerrero cho thấy sự mất kết nối ngày càng tăng trong kỹ thuật tế bào và cho thấy cách phân tích protein thế hệ tiếp theo cuối cùng cũng bắt đầu đóng cửa nó và mở ra các cơ hội khoa học mới.

Khi kỹ thuật di truyền vượt xa phân tích protein

Sự ra đời của CRISPR/Cas9 đã cách mạng hóa bộ gen chức năng bằng cách cho phép sửa đổi gen được nhắm mục tiêu trên hầu hết các loại tế bào, với những tiến bộ gần đây mở rộng khả năng này cho các quần thể khó khăn trong quá khứ như đại thực bào có nguồn gốc từ iPSC và microglia. Tuy nhiên, lời hứa khoa học của CRISPR xoay quanh một bước quan trọng: xác minh rằng một chỉnh sửa được thiết kế tạo ra sự thay đổi mức độ protein dự định.

Đây là nơi mà nhiều nhà nghiên cứu va vào một bức tường. Phương Tây truyền thống - từ lâu đã là tiêu chuẩn để đo lường biểu hiện protein - đòi hỏi khối lượng mẫu tương đối lớn, protein dồi dào và các bước xử lý thực hành mang lại sự thay đổi. Đối với các quần thể hiếm hoặc không tăng sinh, như các tế bào miễn dịch có nguồn gốc từ iPSC, những yêu cầu này có thể bị cấm.

Navarro-Guerrero giải thích: “Chúng tôi chỉ có một số lượng nhỏ tế bào vì dòng tế bào không tăng sinh. Các mẫu protein tôi có rất nhỏ."

Sự không phù hợp giữa kỹ thuật bộ gen tiên tiến và các công cụ phát hiện protein hàng thập kỷ tuổi phản ánh một vấn đề lớn hơn trong sinh học hiện đại. Khi lĩnh vực này tiến tới các hệ thống tế bào nhỏ hơn, phù hợp hơn về mặt sinh lý - bao gồm các mô hình có nguồn gốc từ iPSC, organoid và tế bào miễn dịch nguyên phát - cơ sở hạ tầng phân tích phải phát triển tương ứng. Khi các xét nghiệm protein đòi hỏi nhiều tài liệu hơn mà sinh học có thể cung cấp một cách thực tế, tiến trình sẽ bị đình trệ.

Nút cổ chai phân tích trong nghiên cứu tế bào miễn dịch

Các đại thực bào và microglia có nguồn gốc từ iPSC đóng vai trò là nền tảng mạnh mẽ để mô hình hóa khả năng miễn dịch bẩm sinh, kiểm tra các mục tiêu điều trị và điều tra tình trạng viêm mãn tính, thoái hóa thần kinh và ung thư. Tuy nhiên, những tế bào này đi kèm với những thách thức hậu cần cao.

- Sự tăng sinh thấp, có nghĩa là các nhà nghiên cứu phải làm việc với số lượng tế bào cực kỳ hạn chế.

- Biến đổi cao, đặc biệt là khi có nguồn gốc từ các nhà tài trợ khác nhau hoặc các lô phân biệt.

- Các kiểu hình mong manh, khiến chúng dễ bị căng thẳng từ việc chuẩn bị mẫu.

Đối với các nhà khoa học thiết kế các tế bào này bằng CRISPR/Cas9 hoặc hệ thống phân phối virus, các chỉ số chính xác ở cấp độ protein xác định xem việc chỉnh sửa có thành công, thất bại hay không hoặc tạo ra các hiệu ứng bất ngờ. Các xét nghiệm tiêu chuẩn thường thiếu độ nhạy, thông lượng và tính nhất quán, dẫn đến kết quả không thuyết phục hoặc cần chuyển hướng vật liệu tế bào khan hiếm thành nhiều xét nghiệm.

Chi phí khoa học rất cao. Nếu không có xác nhận protein đáng tin cậy, các thao tác di truyền có thể bị đọc sai, các khám phá bị trì hoãn, và các mục tiêu đầy hứa hẹn có thể bị loại bỏ chỉ vì các công cụ hiện tại không thể mô tả chúng một cách chính xác.

Thách thức này ngày càng phổ biến trong sinh học tế bào hiện đại. Từ các tế bào thần kinh có nguồn gốc từ tế bào gốc đến các tế bào T được thiết kế, các nhà nghiên cứu đang tìm kiếm các quy trình phân tích phù hợp với độ nhạy, tốc độ và khả năng ghép kênh cần thiết cho các mẫu thu nhỏ, có giá trị cao.

Các phương pháp tiếp cận đang phát triển trong phân tích protein

Công trình của Navarro-Guerrero phản ánh một sự thay đổi lớn hơn trong lĩnh vực này đối với các hệ thống xét nghiệm miễn dịch tự động dựa trên mao mạch. Những phương pháp này chỉ sử dụng một lượng protein nhỏ và giảm thiểu sự biến đổi do xử lý thủ công gây ra. Những cách tiếp cận mới hơn này giải quyết ba hạn chế cốt lõi của phương pháp truyền thống ở Tây phương.

1. Yêu cầu về kích thước mẫu: Các nền tảng xét nghiệm miễn dịch mao mạch thu nhỏ chỉ có thể phân tích vài microlít lysate, đạt độ nhạy ở mức picogram. Điều này làm cho việc làm việc với các loại tế bào không tăng sinh hoặc khó phân lập trở nên khả thi mà không cần hy sinh các đối chứng hoặc các thử nghiệm sao chép.

2. Khả năng tái tạo và tự động hóa: Tự động hóa giúp giảm sự thay đổi giữa các bước chạy, loại bỏ các bước chuyển giao thủ công, xử lý màng và phát triển. Đối với các thí nghiệm chỉnh sửa bộ gen - trong đó việc phân biệt giữa loại bỏ một phần và hoàn toàn là điều cần thiết - kết quả nhất quán, có thể tái tạo và đáng tin cậy là rất quan trọng.

3. Phát hiện protein ghép kênh: Các hệ thống hiện đại có thể thẩm vấn nhiều mục tiêu từ cùng một mẫu quý giá. Điều này đặc biệt có giá trị đối với các nghiên cứu về tế bào miễn dịch, nơi các nhà nghiên cứu thường cần theo dõi song song các tầng tín hiệu, các dấu hiệu bề mặt và kết quả chỉnh sửa gen.            

Những tiến bộ này hỗ trợ một cách tiếp cận có hệ thống hơn để nghiên cứu cách các tế bào miễn dịch phản ứng với các thay đổi di truyền. Trong trường hợp của Navarro-Guerrero, các xét nghiệm biểu hiện protein hợp lý cho phép cô xác nhận việc mất ba gen không cần thiết - HPRT1, PPIB và CDK4 - trong các đại thực bào có nguồn gốc từ iPSC được tạo ra thông qua CRISPR/Cas9 và truyền lentivirus. Những loại này, được công bố trên Báo cáo Khoa học vào năm 2021, cung cấp một kế hoạch chi tiết để khám phá chức năng gen trong sinh học đại thực bào rộng hơn.

Cho phép khám phá có hệ thống các con đường miễn dịch

Với xác nhận mức protein đáng tin cậy, phạm vi kỹ thuật tế bào miễn dịch mở rộng đáng kể. Công trình của Navarro-Guerrero chứng minh cách phân tích protein được cải thiện có thể:
- Điều tra vai trò của đại thực bào trong viêm mãn tính, thoái hóa thần kinh và tiến triển khối u.
- Đánh giá kết quả kiểu hình của chỉnh sửa đa gen.
- Xây dựng các mô hình dự đoán dựa trên nguồn gốc từ iPSC để sàng lọc thuốc và phát triển liệu pháp.
- Khám phá các ứng dụng sinh học tổng hợp và kỹ thuật trị liệu trong các tế bào miễn dịch bẩm sinh.
           
Khả năng xác nhận các chỉnh sửa gen một cách tự tin đẩy nhanh việc kiểm tra giả thuyết và giảm phỏng đoán thực nghiệm, thường tốn nhiều tháng nỗ lực.

Phân tích biểu hiện protein phù hợp với sinh học hiện đại

Khi nhiều phòng thí nghiệm áp dụng các tế bào có nguồn gốc từ iPSC, hệ thống đơn tế bào và các chiến lược chỉnh sửa gen ngày càng phức tạp, áp lực hiện đại hóa phân tích protein đang gia tăng. Lĩnh vực này đang hướng tới các công cụ nhạy cảm hơn, tự động hóa, ghép kênh và tích hợp hơn, có khả năng kết nối các bản đọc protein với quy trình làm việc về bộ gen và phiên mã.

Sự không phù hợp lâu dài giữa sinh học tiên tiến và các công cụ phân tích kế thừa đang bắt đầu tan rã. Công trình của Navarro-Guerrero đưa ra một ví dụ cụ thể về cách các nhà nghiên cứu vượt qua những hạn chế về xét nghiệm thông qua các công nghệ mới nổi phù hợp hơn với thực tế của kỹ thuật tế bào hiện đại. Bằng cách thu hẹp khoảng cách giữa chỉnh sửa bộ gen và xác nhận protein, các nhà khoa học có thể thẩm vấn chức năng tế bào miễn dịch với độ phân giải cao hơn, biến các quần thể tế bào hiếm thành các hệ thống mạnh mẽ để khám phá.
 
Nguồn: https://www.drugdiscoverynews.com/how-researchers-are-overcoming-assay-limitations-in-protein-analysis-17125