Trung tâm công nghệ sinh học Thành Phố Hồ Chí Minh

Cá ngựa vằn (Danio rerio) – loài cá nước ngọt vằn sọc xanh dương đặc trưng – thường được dùng làm mô hình nghiên cứu sinh học. Cá này có hai gen keap1 paralog (keap1a và keap1b), tạo điều kiện đặc biệt để nghiên cứu hệ thống Keap1–Nrf2. Trong hệ thống này, Keap1 hoạt động như bộ cảm biến stress oxy hóa: ở điều kiện bình thường, Keap1 liên kết và giữ Nrf2, ngăn không cho Nrf2 kích hoạt các gen chống oxy hóa; khi tế bào gặp stress oxy hóa (ví dụ tiếp xúc với H₂O₂), Keap1 được bất hoạt và giải phóng Nrf2 để Nrf2 di chuyển vào nhân và khởi động biểu hiện hàng loạt gen bảo vệ tế bào. Hệ Keap1–Nrf2 giữ vai trò then chốt trong bảo vệ tế bào khỏi tác hại của các tác nhân oxy hóa và giúp cơ thể thích nghi với môi trường.

CRISPR-Cas9 – công cụ chỉnh sửa gen
 

Công nghệ CRISPR-Cas9 gồm RNA dẫn đường (gRNA) và enzym Cas9: gRNA dẫn Cas9 đến mục tiêu gen keap1a, Cas9 sau đó cắt đôi sợi DNA tại vị trí đó. Khi DNA bị cắt, tế bào tự sửa chữa bằng cách nối lại các đầu đứt gãy, thường qua cơ chế nối không tương đồng (NHEJ) hoặc tái tổ hợp (HDR); quá trình này thường tạo ra các đột biến, như mất đoạn hoặc thêm nucleotide tại vị trí cắt. Tính đơn giản và hiệu quả của CRISPR-Cas9 đã làm nó trở thành phương pháp lý tưởng để chỉnh sửa gen ở nhiều loài, kể cả ở cá ngựa vằn.

Quy trình knock-out gen keap1a
Quy trình chính để tạo cá ngựa vằn knockout gen keap1a bao gồm các bước chính như sau:

1. Thiết kế gRNA: Xác định trình tự DNA đặc hiệu trong gen keap1a và tổng hợp RNA dẫn đường (gRNA) tương ứng. gRNA này đảm bảo Cas9 sẽ nhận diện và cắt đúng vị trí trên gen keap1a.
2. Tạo phức hợp gRNA/Cas9 và tiêm vào phôi: Trộn gRNA đã thiết kế với enzym Cas9 và tiêm hỗn hợp này vào phôi cá ngựa vằn ở giai đoạn một tế bào. Kỹ thuật microinjection giúp đưa chính xác gRNA và Cas9 vào bên trong phôi.
3. Nuôi cá và chọn lọc đột biến: Cho phát triển cá F0 (thế hệ đầu tiên) từ các phôi đã tiêm. Sau khi F0 trưởng thành, lai chéo để tạo F1. Sàng lọc các cá thể mang đột biến gen keap1a bằng các xét nghiệm sinh học phân tử.
4. Phân tích kiểu gen: Xác nhận đột biến bằng phương pháp PCR và giải trình tự DNA. Kỹ thuật này giúp khẳng định gen keap1a đã bị cắt và chỉnh sửa như mong muốn.

Kết quả nghiên cứu
Các kết quả thí nghiệm cho thấy cá ngựa vằn knockout gen keap1a phát triển và sinh sản bình thường, không có khác biệt rõ rệt so với cá thường. Tuy nhiên, khi tiếp xúc với chất oxy hóa (H₂O₂), những con cá mang đột biến keap1a cho thấy khả năng chịu stress oxy hóa vượt trội: tỷ lệ sống sót của chúng cao hơn so với cá thường và mức biểu hiện của các gen đích dưới sự điều khiển của Nrf2 là gstp1 và prdx1 tăng rõ rệt. Những kết quả này cho thấy việc loại bỏ keap1a kích hoạt liên tục hệ Nrf2, nhờ đó cá tăng cường biểu hiện gen chống oxy hóa và kháng lại stress tốt hơn. (Kết quả trên thuộc đề tài NAFOSTED mã số 108.06-2020.19.)

 
Ý nghĩa ứng dụng
Nghiên cứu này không chỉ cung cấp một quy trình knock-out gen hiệu quả ở cá ngựa vằn, mà còn mở ra triển vọng ứng dụng rộng rãi của công nghệ CRISPR-Cas9 trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam. Việc tạo ra cá mang đột biến ở gen keap1a với khả năng chống chịu stress oxy hóa cao làm tiền đề để phát triển các giống cá mới có sức khỏe tốt hơn. Trong tương lai, kỹ thuật tương tự có thể được ứng dụng để tạo ra những giống cá nuôi kháng bệnh hoặc chịu được biến đổi môi trường, từ đó nâng cao năng suất và tính bền vững của ngành thủy sản. Như các tác giả nghiên cứu nhận định, quy trình này mở ra cơ hội mới cho nghiên cứu chức năng gen và phát triển nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam.

(Nguồn: Nguyễn Thành Vũ và cộng sự, Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM)