English Trang chủ  Liên hệ 
   Chức Năng Nhiệm Vụ
   Cơ Cấu Tổ Chức
   SX - Chuyển Giao CN
   Đào Tạo
   Nghiên Cứu
   Hình Ảnh Hoạt Động
   Hội nghị Nấm học: Nghiên cứu và ứng dụng tại khu vực phía Nam năm 2014
   Cây trồng Công nghệ Sinh học
   Tin khoa học
   Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc - Khu vực phía Nam lần III, 2013
   Thông tin tuyển dụng
   Tin hoạt động, hội thảo, hội nghị
   Văn bản pháp quy
   Sản phẩm - Thị trường
   Sản xuất và chuyển giao công nghệ
   Kiến Thức Cơ Bản
   CNSH Nông Nghiệp
   CNSH Y Dược
   CNSH Môi Trường
   CNSH Thực Phẩm
   Các Vấn Đề Khác
   Kiến Thức Cơ Bản
   Qui Trình Kỹ Thuật
2 4 5 8 0 4 5
» Các Vấn Đề Khác  «« Trở về
Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa (27-12-2006)
Phương pháp tủa được sử dụng tương đối rộng rãi để thu nhận các phân tử sinh học mà nhất là protein. Để tủa, người ta có thể dùng nhiều cách khác nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa protein.
 
1. Tủa bằng muối
Đây là cách phổ biến để tủa protein. Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối…
Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out).
Đầu tiên, giả thuyết salting in ở nồng độ muối thấp được giải thích bởi Debye - Huckel. Trong dung dịch, protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang điện tích trái dấu. Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung môi, làm giảm các phân tử protein không mang điện tích, do đó làm tăng tính tan của protein trong dung môi. Giả thuyết của Debye – Huckel cho rằng: tính tan của protein được biểu diễn bằng một hàm logarit, giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion trong dung dịch.
Thuật ngữ salting out trong môi trường có nồng độ muối cao được giải thích bởi Kirkwood. Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình Solvate hóa, giảm tính hòa tan của protein dẫn đến sự tủa.
Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn:
log S = B - KI
Trong đó
S: độ hòa tan của protein
B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ)
K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có trong dung dịch)
I: cường độ ion của muối.
Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối:
 


Hình 1. Độ tan theo nồng độ muối (http://sosnick.uchicago.edu/precpsalt.html)
 
Những đường biểu diễn khác nhau tùy theo từng protein khác nhau. Vì thế, khi muốn tách 1 protein từ một hỗn hợp gồm nhiều protein khác nhau, ta có thể lựa chọn nồng độ muối thích hợp sao cho phù hợp nhất với protein mục tiêu.
Độ dốc của đường salting out mô tả ở trên phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng độ muối, không phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tử của protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống.
Hiệu quả tủa protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate.
 
2. Tủa protein bằng các dung môi hữu cơ
Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi của môi trường giảm xuống. Công thức biểu diễn mối quan hệ giữa độ hòa tan và hằng số điện môi:
ln (S/Sw) = (A/RT) (1/Dw - 1/D)
Trong đó
S: độ hòa tan của protein trong dung môi hữu cơ
Sw: độ hòa tan của protein trong nước
D: hằng số điện môi của môi trường sau khi đã bổ sung dung môi hữu cơ vào
Dw: hằng số điện môi của nước
R: hằng số khí
T: nhiệt độ tuyệt đối
A: hằng số khí
Công thức trên cho thấy: khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp (mặc dù một số dung môi như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl Sulfoxide (DMSO) và Ethanol có thể được sử dụng ở nồng độ cao.
 
3. Tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện
Khi thay đổi pH của môi trường, mức độ tủa của protein cũng thay đổi. Ở pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton). Ở giá trị pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H+). Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không tích điện. Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác với môi trường, khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường. Hiện tượng này được giải thích bằng phương trình Cohn.
Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2 protein khác nhau thay đổi theo pH

 
Hình 2. Tỷ lệ protein tủa theo pH (http://sosnick.uchicago.edu/precpph.html

 

)
 
Phương pháp này thường dùng cho các protein đậu nành (có điểm đặng điện khoảng 4.6)
 
4. Tủa protein bằng các non – ionic polymer
Phương pháp này được thực hiện bằng cách cho thêm non – ionic vào trong dung dịch protein. Khi thêm vào, số lượng các phân tử nước có thể tương tác được với protein giảm xuống. Người ta thường sử dụng dextrans và polyethylen glycols.
µi = µi0 + RT (ln mi + fii mi + fij + mj)
Trong đó
µi0: điện thế hóa học chuẩn của phần tử i
µi: điện thế hóa học của phần tử i
R: hằng số khí
T: nhiệt độ tuyệt đối
mi, mj: nồng độ molar của phần tử i và j
fii: hệ số tương tác của phần tử i
fij: hệ số tương tác giữa phần tử i và j
Khi protein tồn tại ở nồng độ cao, hay pH môi trường vượt ra ngoài điểm đẳng điện mới xảy ra quá trình tương tác giữa các cấu tử trong protein.
Muốm thêm loại non – ionic polymer nào vào trong dung dịch protein tùy thuộc vào trọng lượng phân tử của protein đó. Cũng tương tự như tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện. Tại 1 giá trị pH nào đó (sau khi thêm non – ionic polymer) thì khả năng hòa tan của protein cũng giảm xuống. Các ion non – ionic polymer thường sử dụng là các dung môi hữu cơ như Ethanol hay Acetone. Các dung môi khác ít sử dụng vì khó thao tác và có thể gây biến tính protein.
 
Chú ý:
- Nhiệt độ thấp làm tăng hiệu quả tủa và giảm sự biến tính protein.
- Nồng độ ion: 0.05 – 0.2.
- Đối với chất tan có trọng lượng phân tử càng cao thì lượng dung môi cần cho quá trình tủa càng ít. Theo Scopes (1982), khi bắt đầu tủa protein bằng Acetone, nên tuân theo công thức sau:
[(v/v)%] = 1.8 - 0.12 ln [MW]
Trong đó
(v/v)% là thể tích dung môi cần cho quá trình tủa – tính theo %
MW: trọng lượng phân tử của chất tan
Nếu trong hỗn hợp có sự hện diện của 2 protein, tính tan của protein này sẽ giảm vì sự hiện diện của protein kia.
Thuận lợi của phương pháp tủa bằng cách sử dụng non – ionic polymers là protein sản phẩm bền, và có thể sử dụng ở nhiệt độ phòng.
 
5. Tủa bằng ion kim loại
Trong phương pháp tủa này, ion kim loại sẽ gắn với một phần của phân tử protein. Thuận lợi của phương pháp này là có thể tủa được protein trong một dung dịch rất loãng. Các ion kim loại có thể chia làm ba nhóm. Các ion như Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ và Cd2+ sẽ gắn chặt vào các acid carboxylic và các hợp chất có chứa nitrogen. Các ion như Ca2+, Ba2+, Mg2+ và Pb2+ sẽ gắn với nhóm chức acid carboxylic. Các ion như Ag2+, Hg2+, và Pb2+ sẽ gắn chặt với các nhóm có chứa lưu huỳnh.
 
MỘT SỐ PROTOCOL THAM KHẢO
 
Tủa protein bằng acetone
1. Làm lạnh acetone xuống – 200C.
2. Chuyển mẫu protein vào trong các tube eppendorff thích hợp.
3. Thêm 4 lần thể tích acetone lạnh vào tube.
4. Vortex, ủ ở - 200C trong 60 phút.
5. Ly tâm ở 13.000 – 15.000 x g trong vòng 10 phút.
6. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi. Tránh chạm tới phần cặn protein.
(Nếu muốn loại bỏ hoàn toàn các chất tạp nhiễm, có thể lặp lại các bước từ 2 – 6) trước khi tiến hành bước 7)
7. Để cho acetone bay hơi tự do ở nhiệt độ phòng trong vòng khoảng 30 phút.
 
Tủa bằng Acetone/TCA (Trichloroacetic acid)
1. Chuẩn bị dung dịch TCA 10% trong aceton. Bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng.
2. Thêm 10 thể tích TCA 10% trong acetone vào mẫu. Vortex. Ủ ở - 200C ít nhất 3h (tốt nhất nên ủ qua đêm).
3. Ly tâm ở 15 000 x g trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi.
4. Thêm 1 thể tích acetone lạnh ( - 200C). Vortex. Để ở - 200C ít nhất 10 phút.
5. Ly tâm 15000 x g trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi.
6. Để cặn khô tự nhiên trong không khí.
 
Tủa bằng TCA/DOC (Deoxycholate)
1. Chuẩn bị dung dịch DOC 2%.
2. Trộn mẫu với DOC 2% theo tỉ lệ 1/1000. Ủ trên đá 30 phút.
3. Thêm TCA 100% vào mẫu sao cho nồng độ cuối cùng của TCA là 15%. Vortex ngay (để tránh các khối tủa lớn hình thành có thể manh theo các phần tử tạp nhiễm).
4. Để yên ít nhất 1h. Tốt nhất là ủ qua đêm.
5. Ly tâm 15 000 x g trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi có chứa TCA và các chất tạp nhiễm
6. Thêm Ethanol lạnh hay Acetone lạnh vào cặn để rửa.
7. Vortex kỹ cho cặn tan hoàn toàn. Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
8. Ly tâm 15 000 x g trong 10 phút. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi.
9. Lặp lại bước rửa, ly tâm, loại dịch nổi.
10. Làm khô cặn.
 
Tủa bằng Chloroform/Methanol
1. Thêm 4 thể tích Methanol vào mẫu. Vortex kỹ.
2. Thêm 1 thể tích Chloroform. Vortex.
3. Thêm 3 thể tích nước. Vortex.
4. Ly tâm 15 000 x g trong 2 phút. (Lúc này, protein có thể còn trên phần dịch nổi). Loại đi phần nước ở lớp trên.
5. Thêm 4 thể tích Methanol. Vortex.
6. Ly tâm 15 000 x g trong 2 phút. Cẩn thận loại bỏ hoàn toàn dịch nổi. Tránh chạm đến phần cặn.
7. Làm khô mẫu bằng buồng hút chân không hay bằng không khí.
 
 
V.T.M. Tâm
(Tổng hợp từ:
  Gửi cho bạn bè In Bản Tin
 
Bài mới nhất :
Xăng sinh học - Phần 3 (03-04-2008)
Xăng sinh học - Phần 2 (03-04-2008)
 
Các bài tiếp theo :
Các loài công trùng và các loại ứng dụng (23-12-2006)
Tinh sạch PROTEIN (Phần 1) (13-11-2006)
Ứng dụng hệ thống Bioreactor trong sản xuất số lượng lớn cây dược liệu và hoa cảnh (10-11-2006)
 
Lễ Khánh thành khu nhà kính, nhà lưới, nuôi cấy tế bào thực vật
Lễ Khởi công xây dựng các dự án thành phần Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM
Quang cảnh các tiểu ban trong Hội nghị Công nghệ Sinh học Toàn quốc - Khu vực phía Nam lần 2 - năm 2011
Chủ tịch UBND TP. HCM Lê Hoàng Quân đến thăm và làm việc tại Trung tâm CNSH TP.HCM
Hội nghị khu vực năm 2012 của Hiệp hội Công nghệ Sinh học Châu Á (AFOB) ngày 10/02/2012
Hội nghị tổng kết xây dựng mô hình xã nông thôn mới tại xã Tân Thông Hội ngày 22/12/2011
Lễ Khai mạc và Phiên toàn thể
Các giống hoa cấy mô của Trung tâm Công nghệ Sinh học
Hội thảo "Lợi ích của cây trồng biến đổi gen đối với an ninh lương thực và phát triển bền vững" ngày 27/09/2010
Lớp tập huấn ngắn hạn kỹ thuật LAMP
Lễ Khởi công Dự án xây dựng Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM ngày 25/05/2010
All contents © copyright by Biotechnology Center, Inc. All right reserved.
  Trung tâm Công Nghệ Sinh Học
TP Hồ Chí Minh
176 Hai Bà Trưng , quận 1, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
Điện thoại: (84 - 8) 38 225 202 – Fax: (84 - 8) 38 222 567
Hoặc: Km 1900, Quốc lộ 1A, phường Trung Mỹ Tây, Q.12, TP.HCM, Việt Nam.
Điện thoại: (84-8) 37 155 739 - 37 159 511.
Fax: (84-8) 38 91 69 97.